金花茶(Camellia nitidissima Chi)属于山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)金花茶组(Sect. Chrysantha)的常绿灌木。据文献报道，目前全球共有金花茶组植物24种5变种，其中21种5变种分布于中国南部及西南部地区(梁盛业, 1993, 林业出版社, pp.1-5), 因其花冠黄色而具有重要的园艺价值，被誉为“茶花皇后”。近年来，由于栖息地的丧失，濒危物种资源的过度采集和非法出口贸易，其自然种群急剧下降。金花茶被列为国家一级重点保护植物，IUCN红色名录中最濒危的植物种类之一。建立准确的金花茶植物鉴定方法是其生物多样性保护和研究的关键。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)是指由于单个核苷酸的变异所形成的遗传标记，其数量多、多态性丰富、适于快速、自动化分析(Mochida et al., 2003)。SNP的检测方法有多种，如：基因测序技术、阵列杂交分析、高效变性液相色谱检测等(Jehan and Lakhanpaul, 2006)，但是由于技术难度高、成本费用高，阻碍了其应用。酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphic sequence, CAPS)是根据SNPs位点的DNA序列设计特异的PCR引物，与限制性内切酶相结合产生的一种分子标记。但SNP恰好位于限制性酶切位点这种情况比较少，为了能够检测所有可能的SNPs位点，衍生型酶切扩增多态性序列(derived cleaved amplified polymorphic sequence, dCAPS)技术通过在扩增引物中加入错配碱基，结合SNP位点引入限制性内切酶位点，从而可以酶切检测几乎所有SNPs (Michaels and Amasino, 1998)。dCAPS技术自发明以来大量应用于分子遗传学及种质资源品种品系鉴定等方面研究，该技术已在水稻(Komori and Nitta, 2005；赵红敬等, 2011)、拟南芥(Nemri et al., 2007; Hou et al., 2010)、小麦(Yanagisawa et al., 2003)、大麦(Shahinnia and Sayed-Tabatabaei, 2009)、葡萄(Boss and Thomas, 2002)、香蕉(Umali and Nakamura, 2003)、山茶(张成才等, 2012)等作物中得到了广泛的应用。

本研究通过对金花茶psbA-trnH、rbcL、trnL-F、GBSSI基因的PCR扩增，通过生物信息学方法进行SNP位点序列分析，设计金花茶物种特异的PCR引物，应用专一的限制性内切酶，最终将SNPs转化为dCAPS标记进行检测，建立了金花茶物种的快速鉴定方法。

1结果与分析
1.1序列比对及SNP位点分析
对金花茶组植物psbA-trnH、rbcL、trnL-F、GBSSI基因的序列进行分析，四个基因的扩增效率均为100%，扩增序列片段长度排序后分别为 469 bp、732 bp、976 bp、759 bp，GBSSI基因序列提供最多的变异位点(53个)及最多的信息位点(21个) (表1)。因此，后续选择GBSSI基因序列对金花茶组植物进行物种特异引物的设计。

表1 四个基因片段的信息参数 Table 1 Informative parameters of the four DNA regions

1.2 dCAPS标记的转化
序列比对分析中发现金花茶的GBSSI基因的第141个碱基为T，而其它种为C (图1)。根据此SNP位点设计合成dCAPS引物(图2; 表3)，错配碱基为C→A(图2)。dCAPS引物和下游引物PCR扩增出单一的目的条带为254 bp，结果与预期一致(图3A)。用相应的限制性内切酶对扩增产物进行酶切，酶切产物中只有金花茶(图3B)有254 bp和229 bp两个片段，而其它近源种只有一个254 bp片段，从而将金花茶与其它近源种分开。

图1 金花茶与其它近源种的GBSSI基因部分序列比对分析 Figure 1 Partial sequence alignment of the GBSSI gene region showing the Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) between C. nitidissima and other closely-related species

图2 金花茶dCAPS引物设计 Figure 2 The design of dCAPS primer

 

图3 dCAPS标记鉴定金花茶的PCR分析 Figure 3 PCR analysis for identification of C. nitidissima using dCAPS marker system

2讨论
单核苷酸多态性标记因为数量多、分布广泛、适于快速规模化筛选等优点在遗传图谱构建、种质资源遗传多样性、分子育种等领域有广泛的应用前景。SNP的开发和检测技术也不断发展成熟。目前，发掘SNP标记的方法主要包括：基于表达序列标签(expressed sequence tag, EST)数据开发SNP位点、基于微阵列芯片开发SNP、扩增子重测序开发SNP和基于全基因组序列的SNP标记开发(洪彦彬等, 2011; 张成才, 2012)。SNP的检测技术多种多样，如：凝胶分析技术、荧光检测技术、DNA芯片检测、质谱检测技术和色谱技术等，但是它们多数对设备和技术要求高，成本较高(张成才, 2012)。

本实验针对金花茶物种设计了特异引物，能迅速地将金花茶与山茶属其它近源种区分，其中dCAPS引物的设计是将SNP转化为dCAPS标记的关键，通过软件共设计了16个dCAPS上游引物，引物中错配碱基的数目、距离引物3′端的位置都会影响标记的应用(Neff et al., 2002; Neff et al., 1998)。本实验选择了错配碱基数目为1个，距离3′端第6位置的引物，PCR产物经酶切后得到与预期相同的结果。表明错配碱基在距离引物3′端较远的位置能够引入PCR扩增产物中，从而在包含目的SNP的目标DNA中创建了一个特异性酶切位点。鉴于此方法建立了基于SNPs的dCAPS标记技术鉴定金花茶物种的方法体系，从而达到可以快速、准确检测物种特异SNPs的目的，dCAPS标记的成功开发，对于口岸物种查验工作及品种资源鉴别、种质资源保护具有重大意义。
 
3材料与方法
3.1试剂与材料
DNA提取所用试剂购自TIANGEN公司，PCR扩增所用试剂及限制性内切酶均购自Takara公司。实验所用植物材料(表2)，所有供试植物材料均为硅胶干燥保存的叶片。

表2 实验所用植物材料 Table 2 Plant materials in this study

3.2方法
3.2.1 DNA提取和条码基因扩增及测序
金花茶物种基因组DNA提取按照TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒进行，并将提取的DNA置于-20℃下保存备用。

根据文献中条码基因psbA-trnH (Kress and Erickson, 2007)、rbcL (Kress and Erickson, 2007)、trnL-F (Taberlet et al., 1991)、GBSSI (杨俊波等, 2006)的引物及扩增条件(表2)进行扩增，PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测并在紫外凝胶成像系统观察合格后, 由中国农科院测序中心测序。

3.2.2序列比对及物种特异的dCAPS标记的开发
序列编辑和拼接应用CodonCode Aligner V3.0 (CodonCode Co., USA)，17个物种的GBSSI基因序列提交GenBank并获得序列号KC844915, KC878512-KC878527 (表1)。通过DNAman software进行序列比对寻找合适的SNP位点。

利用dCAPS Finder 2.0 program (Neff et al., 2002) 和Primer Premier 5.0分别设计dCAPS引物及相应的下游引物(表3)，由上海生物工程技术服务有限公司合成。以17个山茶属物种基因组DNA为模板，25 μL PCR反应体系中包括：2.5 μL 10× EX Taq buffer (Mg²⁺ Plus)，2 μL dNTPs (2.5 mmol/L)，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，0.2 μL EX Taq DNA polymerase (5 U/μL)，1 μL基因组DNA (50 μg/μL)。 PCR扩增程序：94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 50 s，35个循环，72℃终延伸10 min，4℃保存(宋云等, 2012)。PCR扩增结束后，采用限制性内切酶BstXI酶切，酶切反应体系参照Takara内切酶说明书进行，酶切产物经过2.5% MetaPhor agarose电泳检测，通过紫外凝胶成像系统记录结果。
 

表3 本文所用PCR扩增引物 Table 3 Primers used in the study

作者贡献
宋云、徐晗是本研究的实验设计和实验研究的执行人；许瑾、赵竹完成数据分析，论文初稿的写作；李明福参与实验设计，试验结果分析；宋云是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家质检总局科技计划项目(2012IK295)、国家科技支撑计划项目(2012BAK11B01)、中国检验检疫科学研究院基本科研业务费专项(2012JK004) 、国家质检总局物种资源检验检疫业务工作专项共同资助。

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